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Système d'éclairage modulaire

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Système d'éclairage modulaire avec une ultime flexibilité et une grande possibilité d’évolution.

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Le système Ti-LAPP Nikon fournit des systèmes d’éclairages modulaires pour une fluorescence TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence), une photoactivation / photoconversion, un photoblanchiment et  de l’épi-fluorescence. Chaque module peut être combiné de manière flexible pour construire des  systèmes de microscopie optimisés pour des besoins de recherche individuels/propres. Par exemple, de multiples modules TIRFpeuvent être incorporés sur un seul microscope pour des expériences d'anisotropie et l'imagerie TIRF rapide avec plusieurs angles d’incidence. Combiné avec la structure en strate du Ti, jusqu’à cinq modules d'éclairages peuvent être montés sur  un seul microscope (par exemple, deux TIRF, un FRAP, un DMD et un module Epi-FL peuvent tous être intégrés à un seul Ti).

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Système d'éclairage modulaire TI-LAPP

Caractéristiques clés

Module DMD

Réaliser simultanément  une photoactivation multipoint

Ti System with DMD module

Le nouveau module DMD permet une photoactivation et une photoconversion de patterns  et de positions choisis  par l'utilisateur alors que le FRAP classique permet uniquement une photoactivation d'un point positionné manuellement. La forme, la taille, la position et le nombre  de zones éclairées par le DMD peuvent être librement personnalisées à l'aide du logiciel NIS-Eléments. Cette fonctionnalité permet aux chercheurs de marquer de façon idéale un sous-ensemble de cellules ou de populations de protéines au sein d'une seule ou de plusieurs cellules afin de suivre leur comportement. Le module DMD est également parfaitement adapté pour des expériences d’optogénétique pour lesquelles des ROI fortement personnalisées peuvent être utilisées  afin d’induire optiquement des modifications fonctionnelles de sous-ensemble de cellules et de populations de protéines. Le module DMD peut être utilisé avec une source laser ou LED moins phototoxique.

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Fibroblastes embryonnaires de souris co-exprimant une lamine A marquée à la mCherry (rouge) et une lamine A marquées à la GFP photo-activable (vert) qui est photo-convertie dans la région inférieure droite utilisant le module DMD et l'éclairage LED à 405 nm. Des images time-lapse ont été capturées avec  un éclairage en épi-fluorescence. Via la photoactivation d'une sous-population de protéines de lamine, il est possible d'observer la dynamique et le comportement des échanges des sous-unités.

Photos avec l’aimable autorisation des Dr : Takeshi Shimi et Bob Goldman, Northwestern University Medical School


Module H-TIRF

Ajustement et observation TIRF entièrement automatisés sont  maintenant possibles

Ti System with H-TIRF module

L'angle d'incidence idéal et la mise au point du laser pour l'observation TIRF varient en fonction de l'échantillon et des conditions d'observation. Le réglage de l'angle d'incidence et la mise au point pour atteindre la position TIRF nécessite des compétences et de l'expérience. Le nouveau module H-TIRF règle automatiquement la mise au point et l'angle d'incidence du laser pour une observation TIRF en contrôlant le faisceau réfléchi. Ce réglage automatique de mise au point et d'angle d'incidence est effectué grâce à la fonction d'auto-alignement présente dans le logiciel NIS-éléments. Les angles d'incidence et la profondeur de pénétration des ondes évanescentes peuvent être enregistrés et reproduits pour des expériences ultérieures afin d'assurer des résultats d'imagerie cohérents.

Le module H-TIRF est configuré avec un filtre de gradation à densité neutre (ND) qui peut être positionné dans le trajet optique pour obtenir un champ d'éclairage  TIRF homogène.

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Une préparation in vitro de microtubules marqués en fluorescence (tétraméthyl-rhodamine et Alexa 647) et des protéines de liaison de la tubuline (Alexa 488) ont  été imagées en trois longueurs d'ondes différentes avecl'éclairage H-TIRF et du filtre de progression ND. Pour des observations avec plusieurs longueurs d'onde, les angles d'incidence peuvent être ajustés automatiquement.

La vidéo de cette image se trouve dans la page « Exemples d'images ».

Photos avec l’aimable autorisation de  Melissa Hendershott et Dr. Ron Vale, University of California, San Francisco


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Sans le filtre de gradation ND, l'éclairage TIRF présente, dans le champ d'observation, un profil gaussien avec un centre plus lumineux.

Grâce à un filtre de gradation ND, un éclairage TIRF très homogène est obtenu.

Une préparation in vitro d’une membrane bi-lipidique contenant des protéines associées à la membrane marquées à l’Alexa 488 (vert) et à l’Alexa 561 (rouge) a été imagée en utilisant l'éclairage H-TIRF et deux longueurs d'onde différentes (TIRF bicolore). Les protéines se regroupent pour former des amas visualisés comme des structures circulaires ( ligne supérieure). 

La ligne inférieure montre le canal 488  avec un affichage  utilisant une table de conversion  arc-en-ciel où des intensités différentes sont représentées par des couleurs différentes.

L'éclairage H-TIRF peut être utilisé pour automatiser la recherche des  angles d'incidence optimaux  des différentes longueurs d'onde.

Photos avec l’aimable autorisation des Dr : Xiaolei Su et Ron Vale, University of California, San Francisco


Module FRAP

Pour l'analyse de la dynamique des protéines intracellulaires

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Avec ce module FRAP, il est possible de réaliser  un photoblanchiment ainsi que des expériences de photoactivation / photoconversion couplées à une caméra pour la détection à  fréquence d'images élevée et  à haute sensibilité. Ce module peut éclairer le point d'une position cible dans la cellulefournissant un outil à moindre coût pour l'étude de la dynamique des protéines intracellulaires sans l'utilisation d'un microscope confocal.

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Un fibroblaste embryonnaire de souris exprimant la mCherry-lamine A a été photoblanchi dans le coin supérieur droit du noyau par l’utilisation du module FRAP afin d’étudier la dynamique des molécules de lamine A. Des images time-lapse ont été acquises avec un éclairage par épi-fluorescence.

Photos avec l’aimable autorisation des Dr : Takeshi Shimi et Bob Goldman, Northwestern University Medical School


Module TIRF

Pour l'observation de la dynamique membranaire de la  cellule et des molécules uniques

Ti system with TIRF module

Le module TIRF manuel nouvellement conçu comprend un filtre de gradationND (semblable à celui du  module H-TIRF) ce qui permet un éclairage TIRF uniforme à travers tout le champ d'observation. Grâce à l'utilisation des caméras à haute sensibilité, il est possible d’imager des molécules individuelles et la dynamique des protéines dans et à proximité de la membrane cellulaire en utilisant cet éclairage TIRF.


Combinaison flexible de modules

La modularité du système Ti-LAPP et la capacité de configuration flexible offrent des solutions d'imagerie personnalisées pour répondre aux besoins spécifiques de la recherche. Les modules peuvent être également facilement échangés ou ajoutés pour s'adapter à l'évolution des besoins expérimentaux, une caractéristique essentielle pour les laboratoires avec des orientations de recherche évolutives et les plateformes multi-utilisateurs. Par exemple, en ajoutant un deuxième module TIRF à une configuration en mono TIRF, les utilisateurs peuvent facilement réaliser des expériences d’anisotropie et des expériences de TIRF multi-angles rapides. L'ajout d'un module de photoactivation /conversion tel que le module DMD ou le module FRAP permet de suivre une sous- population de protéines, mettant en évidence les comportements de protéines qui autrement seraient impossible à visualiser en imageant toute la population.

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Capacité de configuration en double étage

Grâce à la structure en strate du Ti de Nikon, des modules peuvent être incorporés  sur deux étages séparés avec plusieurs modules par étage. L'utilisation d'une configuration en double étage permet une configuration optimale des filtres pour chaque module d'illumination.  Par exemple, en plaçant le module H-TIRF à l’étage inférieur et un module DMD à l’étage supérieur, des cubes-filtres spécifiques et distincts pour l'imagerie TIRF et la photoactivation peuvent être utilisés simultanément dans les tourelles de filtres respectives qui se trouvent sur les étages inférieurs et supérieurs. Cette configuration permet donc une sélection optimale des filtres et améliore la précision expérimentale tout en maintenant des vitesses d'acquisition des plus élevées.

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La figure de droite est une cellule Drosophila S2 exprimant la tubuline marquée à l’EOS. L'extrémité d'un microtubule individuel a été photoconvertie en utilisant le module DMD et l'éclairage LED à 405 nm. Les images de time-lapse en TIRF bicolore ont été acquises en utilisant l'éclairage H-TIRF. L'ajout de tubuline verte non convertie à l’extrêminté du microtubule rouge photoconverti et le raccourcissement (ou la disparition éventuelle) du segment photoconverti démontrent la propriété de dynamique des microtubules.  Les flèches marquent l’extrémité en croissance et le rétrécissement du segment du  microtubule photoconverti.

Photos avec l’aimable autorisation des Dr : Nico Stuurman et Ron Vale, University of California, San Francisco



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