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Nikon

Nikon Instruments Europe B.V. | France

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Microscope confocal et multiphoton

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Imagerie confocale et multiphoton plus rapide, plus en profondeur, plus précise

Le microscope confocal et multiphoton A1R MP+ de Nikon est un système d'imagerie multiphoton unique équipé d'un scanner galvanométrique rapide, haute résolution et d'un scanner résonnant à très grande vitesse capable d'un débit d'image de 30 fps à 512 x 512 pixels et pouvant atteindre une vitesse de 420 fps en mode à balayage de bande. Les nouveaux détecteurs non déscannés à 4 canaux dotés d'une sensibilité très élevée, avec une réduction du courant d'obscurité et une large gamme spectrale permettent une séparation en temps réel de sondes rapprochées pour une imagerie spectrale précise et à haut contraste. Ce dispositif est particulièrement important en microscopie multiphoton en raison du chevauchement des spectres d'émission de sondes et d'autofluorescence, souvent inévitable lors de l'utilisation d'une unique ligne de laser.

Caractéristiques clés

New High Definition 1K Resonant Scanner

A1R-1K-HD-Scanner

Comparison of a large FOV image and detailed image of fine structures in a cleared* 2 mm brain slice of H-line mouse.

Photographed with the cooperation of: Drs. Ryosuke Kawakami, Kohei Otomo, and Tomoni Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

*RapiClear1.52, SunJin Lab

Nikon’s new resonant scanner mounted in the A1R HD scan head supports both high speed and high definition imaging. The wide dynamic range and reduced noise level raises the bar for image quality in resonant scanners.

High definition

A new resonant scanner achieves finely detailed images with a maximum resolution of 1024 x 1024 pixels (15 fps). A newly developed sampling method produces sharper images with any configuration: even at lower resolution settings. When combined with Nikon’s high NA objective lenses, the A1R HD can achieve absolute optical precision.

Large field of view

With both 1024 x 1024 pixel resolution and a large field of view (FOV18), the new resonant scanner delivers higher throughput in various imaging applications.

High speed

The fast acquisition speed of the resonant scanner (up to 420 fps depending on scan area) is able to capture images with a very short dwell time, minimizing excitation time and light energy exposure of the samples.

Multicolor

Up to 5 channel (four-channel episcopic detector plus diascopic detector) simultaneous imaging is possible.

Zebrafish heart and blood cells imaged with HD resonant scanner.  Sample courtesy of Martha Marvin, Ph.D., Williams College


Tête de balayage confocale hybride révolutionnaire

Le système A1R+ possède une tête de scanner hybride qui intègre un scanner résonnant à vitesse très élevée ainsi qu’un scanner galvanométrique haute résolution. L'utilisation de ces deux scanners permet des opérations simultanées de photoactivation et d'imagerie ultra rapide rendant possible l'acquisition de rapides changements qui apparaissent après une photoactivation, permettant ainsi l’observation d'interactions intermoléculaires.

A1R-Plus-Hybrid-Scanner

Des cellules de HeLa exprimant Yellow Cameleon 3.60 ont été excitées par de la lumière laser à 457 nm. Après stimulation par de l'histamine, les dynamiques des concentrations en ions calcium ont été observées. Les émissions de CFP (bleu) et de YFP (jaune) sont respectivement représentées en vert et en rouge. Le graphique affiche l’évolution de l'intensité de fluorescence (vertical) en fonction du temps (horizontal). Les lignes vertes et rouges dans le graphique indiquent la variation d'intensité d'émission de CFP (vert) et de YFP (rouge) de la région d'intérêt (ROI). Avec l'augmentation de la concentration en ions calcium dans la cellule, l'efficacité de FRET intermoléculaire entre CFP et YFP au sein de Yellow Cameleon 3.60  augmente, l'intensité de fluorescence de CFP diminue, et l'intensité de fluorescence de YFP augmente. Longueur d'onde du  laser utilisé pour l’imagerie: 457 nm, Taille de l'image : 512 x 512 pixels, 30 fps (avec scanner résonnant) Photos avec l'aimable autorisation de : Dr. Kenta Saito et Prof. Takeharu Nagai, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University


Imagerie in vivo à vitesse élevée

Le scanner résonnant de Nikon est capable d'une imagerie à haute vitesse de 420 fps. L'unicité de ce concept est un miroir résonnant de balayage capable d'imager tous les champs d’observation à des vitesses beaucoup plus élevées que les scanners galvanométriques traditionnels. Le système « optical pixel clock »  de Nikon, qui contrôle la position du miroir résonnant en temps réel, ajuste le pixel clock pour garantir une image plus stable, géométriquement appropriée avec une plus grande uniformité dans l'illumination, le tout à vitesses élevées. Cela permet de visualiser efficacement des changements rapides in vivo, tels que des réactions dans les organismes vivants, des dynamiques et des interactions cellulaires.

A1R-MPplus_invivo_hi_speed

Imagerie d'échantillons profonds avec des détecteurs non déscannés (NDD) à haute sensibilité

En excitation multiphotonique, les émissions de fluorescence en profondeur dans un échantillon sont très diffusées. Par conséquent les détecteurs conventionnels utilisant un pinhole ne peuvent pas fournir des images de fluorescence lumineuses. Le détecteur NDD épiscopique dans le microscope A1 MP+ est placé à proximité de la pupille arrière de l'objectif pour détecter une quantité maximale de signaux d'émission dispersés en profondeur dans des échantillons vivants.

Image in vivo des zones profondes du cortex cérébral d'une souris

Le cortex cérébral d'une souris âgée de 5 semaines (ligne H) a été étudié à l'aide de la méthode de crâne ouvert. La forme complète des dendrites des cellules pyramidales de la couche V exprimant de la EYFP a été visualisée, d’une couche inférieure jusqu’à une couche superficielle. De plus, le signal de fluorescence de la matière blanche dans les zones les plus profondes a également été étudié.

A1R-MPplus_NDD
Gauche Image de la reconstruction 3D  

Photographies avec la collaboration de :

Dr. Tomomi Nemoto,
Research Institute for Electronic Science,
Hokkaido University

Dr. Shigenori Nonaka,
National Institute for Basic Biology

Dr. Takeshi Imamura,
Graduate School of Medicine,
Ehime University

Droite     Images de l’empilement en Z      
  Haut:
Dendrites localisées dans les couches superficielles des cellules pyramidales de la couche V 
25 µm de la surface
 
  Milieu:
Dendrites localisées dans la base des cellules pyramidales de la couche V.
625 µm de la surface
 
  Bas:
Fluorescence de la matière blanche
Longueur d'onde de l'excitation : 950 nm
Objectif : CFI75 Apo 25xW MP (NA 1.10 WD 2.0)
 

Imagerie multi-couleurs du cortex cérébral d’une souris

deep-imaging_6
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Acquisition simultanée de trois canaux chez une souris anesthésiée YFP-H utilisant une excitation IR à 950 nm et imageant la génération de seconde harmonique (SHG) et deux émissions de fluorescence.
Cyan: Signal de SHG de la dure-mère
Jaune: Neurones pyramidaux EYFP dans la couche V du cortex 
Rouge: Vaisseaux sanguins (marqués SRB)

Photographies avec la collaboration de :
Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi et Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

Rendu volumique 3D d'images 

Rendus volumiques tridimensionnels d'un rein marqué avec Hoxb7/myrVenus (Chi et al, 2009 Genesis), utilisant un rendu volumique de pseudo-couleur par code de profondeur pour référencer les profondeurs en Z (pseudo-colorés par profondeur - pas de 1 μm sur 550 μm).

A1R-MPplus_NDD_2

Objectif : CFI Apochromat 25xW MP, zoom de balayage : 1x, taille du pas en Z : 1 μm, longueur d’onde d’excitation IR : 930 nm
Résolution de l'image : 1024x1024 pixels, Volume de l'image : 460 μm (longueur) x 460 μm (largeur) x 600 μm (hauteur)
Photographie avec la collaboration du Dr. Frank Costantini et du Dr. Liza Pon, Columbia University Medical Center, New York


Imagerie à 1300 nm

En plus du détecteur NDD GaAsP compatible avec une longueur d'onde de 1080 nm, il existe un nouveau modèle pour les microscopes droits compatible avec une longueur d'onde de 1300 nm. Ce nouveau détecteur NDD permet une imagerie en profondeur jusqu'à 1,4 mm en combinaison avec une tête de balayage A1 MP+, nouvellement développée et compatible avec une longueur d'onde de 1300 nm.

Imagerie cérébrale profonde in vivo chez une souris avec le détecteur NDD GaAsP compatible avec une longueur d'onde de 1300 nm

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Photographies avec la collaboration de : Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi et Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

Imagerie in vivo d'une souris YFP-H anesthésiée (âgée de 4 semaines) via la méthode de crâne ouvert. Visualisation de tous les neurones pyramidaux de la couche V et des neurones hippocampiques en profondeur. Imagerie tridimensionnelle de dendrites hippocampiques jusqu'à 1,4 mm de profondeur dans le cerveau.

Enregistré avec le détecteur NDD GaAsP épiscopique pour 1300 nm et l’objectif CFI75 Apochromat 25xW MP1300 (NA 1.10, WD 2.0 mm)
Longueur d'onde de l’excitation : 1040 nm

Imagerie bicolore cérébrale in vivo d’une souris avec le détecteur NDD GaAsP compatible avec une longueur d'onde de 1300 nm

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Le cortex cérébral d'une souris YFP-H anesthésiée (âgée de 4 semaines) a été étudié à l'aide de la méthode de crâne ouvert.
Alexa594 a été injectée dans la veine caudale pour visualiser le vaisseau sanguin.

Photographies avec la collaboration de : Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi et Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University


Nouvelle option : double faisceau IR permettant une imagerie multiphoton bicolore simultanée

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Coupe de cerveau vivant exprimant YFP et Rhod-2, simultanément excitée avec des longueurs d'onde de 900 nm et 1040 nm (Objectif CFI75 LWD Apo 25x 1.1 NA W 1300 nm).  Une culture vivante de la coupe d'un rat YFP-VGAT colorée avec rhod-2 AM a été imagée pur mesurer les transits de calcium mitochondrial dans les interneurones hippocampiques.

Image avec l'aimable autorisation de Richard Kovacs, Ph.D., Institute for Neurophysiology, Charité-Medical University, Berlin, Allemagne

Avec l'option du double faisceau IR, les utilisateurs peuvent désormais exciter simultanément deux fluorophores différents tels que GFP et mCherry.  Ceci permet une imagerie multiphoton bicolore ultra-rapide, idéale pour des échantillons dynamiques.  Les faisceaux doubles peuvent également être utilisés pour la stimulation à une longueur d'onde spécifique et l'imagerie avec une longueur d'onde différente, réduisant ainsi les délais normalement présents lors de l'utilisation d'un faisceau unique qui requiert  un verrouillage de modes pour modifier les longueurs d'onde.

Image multiphoton tridimensionnelle d'un poisson-zèbre transgénique 1 dpf (Tg(h2afv:GFP; EF1α: mCherry-zGem)).  Le spécimen  a été traité avec de la Phenyltiourée (PTU), pour inhiber la synthèse de la mélanine et clarifié avec une solution de compensation optique LUCID. Cette lignée transgénique exprime une géminine marquée mCherry et des histones marqués GFP.  L'échantillon a été imagé avec un objectif CFI75 Apo 25xW MP1300 (1.10 N.A., 2.0 W.D.) et excité simultanément avec des longueurs d'onde de 900 nm et 1040 nm.

Image avec l'aimable autorisation de : Drs Toshiaki Mochizuki et Ichiro Masai, Developmental Neurobiology Unit, OKINAWA Institute of Science and Technology Graduate University

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Vue latérale du tronc d'un poisson-zèbre transgénique à 34 hpf (Tg(h2afv:GFP ; EF1α : mCherry-CAAX)).  L’échantillon a été traitée avec de la Phenyltiourée (PTU), pour inhiber la synthèse de la mélanine et clarifié avec une solution de compensation optique LUCID.  Cette lignée transgénique exprime des protéines membranaires marquées mCherry (violet) et des histones marqués GFP (vert).  Les fibres musculaires ont également été visualisées en utilisant de la SHG (bleu).  L'échantillon a été imagé avec un objectif CFI75 Apo 25xW MP1300 (1.10 N.A., 2.0 W.D.) et excité simultanément avec des longueurs d'onde de 900 nm (pour SHG et GFP) et 1040 nm (pour mCherry).

Image avec l'aimable autorisation de : Drs Toshiaki Mochizuki et Ichiro Masai, Developmental Neurobiology Unit, OKINAWA Institute of Science and Technology Graduate University


NOUVEL objectif pour les techniques d'adaptation d'indice pour tissus

CFIPlan10xCGlyc

Pour ce qui est de la recherche dans le domaine des neurosciences, le besoin est croissant en ce qui concerne l'imagerie plus profonde des tissus cérébraux intacts avec maintien d'une résolution et d'une clarté élevées.

Le CFI Plan Apochromat 10xC Glyc a été développé afin de fournir des capacités d'imagerie pour l'utilisation dans une large gamme de techniques d'adaptation d'indice.

Le support de plusieurs indices réfractifs permet l'observation non seulement avec de l'eau, de l'huile et de la glycérine, mais aussi avec divers liquides d'adaptation d'indice.

Ce nouvel objectif fournit une large correction des aberrations chromatiques et des taux de transmission élevés en intégrant la technologie exclusive Nano-Crystal Coat de Nikon.

Cet objectif à longue distance de travail fournit des images nettes, à contraste élevé, profondément à l'intérieur du tissu avec sa grande ouverture numérique.

Imagerie d'un cerveau entier de souris avec une méthode d'adaptation d'indice

CFIPlan10xCGlyc-diagram

PFC

Striatum

Hippocampe et amygdale

Tranches optiques de cerveau entier de souris de lignée H après adaptation d'indice avec LUCID-A

Objectif : CFI Plan Apochromat 10xC Glyc (NA 0,5, WD 5,5)

Photos offertes par : Les Dr. Ryosuke Kawakami et Tomomi Nemoto, Institut de recherche en science électronique, Université d’Hokkaido


Les objectifs grande Ouverture Numérique (O.N.) de Nikon sont parfaitement adaptés à l'imagerie multiphoton

Les objectifs grande O.N. ont été développés pour mieux corriger les aberrations chromatiques sur une large gamme de longueurs d'onde, de l'ultraviolet à l'infrarouge. L’efficacité de  transmission est  améliorée par l'utilisation de la technologie Nano Crystal Coat exclusive à Nikon.

En particulier, l’objectif CFI75 Apochromat 25xW MP / MP1300 possède la plus grande ouverture numérique du marché (1,10), tout en conservant une distance de travail de 2,0 mm, ce qui en fait un référent dans l’industrie de la microscopie. Il possède également une bague de correction qui corrige  les aberrations sphériques selon la profondeur de l'échantillon et un angle d'accès de 33° pour l’utilisation de pipettes de manipulation, l'adaptant ainsi à l'imagerie multiphoton en profondeur et aux applications de recherche en physiologie.
Nano Crystal Coat est une technologie exclusive à Nikon de traitement optique des lentilles qui utilise un film mince de nanoparticules avec un indice de réfraction très faible, développée à l’origine pour l’industrie des semi-conducteurs. La structure particulaire du Nano Crystal Coat réduit considérablement les reflets parasites et améliore la transmission sur une large plage de longueurs d'onde, en produisant ainsi des images avec un rapport signal sur bruit (S/N) plus élevé.

high-NA1

CFI75 Apochromat 25xW MP CFI Apochromat LWD 40xWI λS

high-NA2

CFI Apochromat 40xWI λS CFI Plan Apochromat IR 60xWI

Apo_LWD_20x

CFI Apochromat LWD 20xWI λS

CFI75 Apochromat
 25xW MP1300
NA 1.10 WD 2.0 Nano Crystal Coat
CFI75 Apochromat
 25xW MP
NA 1.10 WD 2.0 Nano Crystal Coat
CFI Apochromat LWD
 20xWI λS
NA 1.10 WD 2.0 Nano Crystal Coat
CFI Apochromat LWD
 40xWI λS
NA 1.15 WD 0.6 Nano Crystal Coat
CFI Apochromat
 40xWI λS
NA 1.25 WD 0.18 Nano Crystal Coat
CFI Plan Apochromat
 IR 60xWI
NA 1.27 WD 0.17 Nano Crystal Coat

Objectifs pour la microscopie multiphoton


Alignement laser automatique lors du changement de longueur d'onde d'excitation multiphotonique

Auto Laser Alignment

Lorsque la longueur d'onde du laser multiphoton ou la pré-compensation de la dispersion de vitesse de groupe est modifiée, le faisceau laser multiphoton dirigé vers la pupille arrière de l'objectif peut alors changer, entraînant une intensité inégale à travers l'image, ou un léger décalage entre les trajectoires des lasers IR et visible.

La vérification du pointé du faisceau laser IR et la configuration de l'alignement ont toujours été des opérations difficiles. La fonction d'alignement laser automatique de l’A1R MP+, logée dans la tête optique incidente où passe la lumière d'excitation multiphotonique, permet l'alignement automatique du faisceau laser IR en un simple clic dans le logiciel NIS-Elements C.


Favoriser la flexibilité et la facilité d'utilisation

Le logiciel NIS-Elements C permet un contrôle intégré du système d'imagerie confocal, du microscope et des périphériques avec une interface simple et intuitive. Diverses fonctions fiables d'analyse sont également disponibles.


Deux types de têtes de scannage permettant une imagerie à haute vitesse, et de haute qualité

Scanning Heads

A1R+ possède une tête de scanner hybride qui intègre un scanner galvanométrique haute résolution et un scanner résonnant à vitesse très élevée. Le scanner galvanométrique permet une imagerie jusqu'à 4096 x 4096 pixels et une acquisition à grande vitesse de 10 fps (512 x 512 pixels). Un nouveau système A1R MP+ est désormais disponible et compatible avec une longueur d'onde de 1300 nm.



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