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Multiphoton Confocal Microscope

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Captura de imágenes confocal multifotónica más rápida, profunda y nítida

El microscopio confocal multifotónico A1R MP+ de Nikon es un exclusivo sistema de captura de imágenes que cuenta con un explorador galvanómetro rápido y de alta resolución y un explorador resonante de ultra alta velocidad que tiene capacidad para velocidades de fotogramas desde 30 fps a 512 x 512 píxeles hasta incluso 420 fps en modo de exploración de banda. Esto es de especial importancia en un microscopio multifotónico debido al traslapo del espectro de emisión de las sondas y la autofluorescencia, lo cual lo vuelve inevitable al usar una sola línea láser.

  • Más rápido
    • Explorador resonante
    • Explorador híbrido
  • Mayor profundidad
    • NDD de alta sensibilidad
    • Captura de imágenes de 1300nm
  • Mayor nitidez
    • Objetivos de alta AN
    • Alineación automática del láser

Key Features

Explorador resonante que permite la captura de imágenes de hasta 420 fps

El explorador resonante exclusivo de Nikon tiene capacidad de capturar imágenes en un área amplia a mucha más alta velocidad que un explorador no resonante, haciendo posible la captura de imágenes a 420 fps, la más rápida del mundo mediante la tecnología de exploración de punto. El NDD para la microscopía multifotónica hace posible capturar imágenes rápidas y profundas a través de las muestras más gruesas. El sistema cronométrico óptico de pixeles de Nikon permite imágenes más estables y uniformemente iluminadas aun a altas velocidades.

High Speed Imaging

Visualización de la microcirculación intravital

 Las células sanguíneas en los vasos sanguíneos dentro de un organismo vivo se calibraron con un láser de IR pulsado por un femtosegundo con el explorador resonante de ultra alta velocidad del A1R MP+ y sus movimientos se capturaron  simultáneamente en tres imágenes de fluorescencia sucesivas a 30 fps (30 mseg.), con tres canales de color separado.

Tres sondas fluorescentes se calibran y  simultáneamente se calibran el  núcleo (azul), endotelio (verde) y plasma (rojo). El láser ultra rápido de larga longitud de ondas en combinación con el explorador resonante de ultra alta velocidad reducen eficazmente el fotodaño y hace posible la captura multifotónica de imágenes de biomoléculas en resolución temporal.

Resolución de las imágenes: 512 x 512 píxeles, velocidad de captura de imagen: 30 fps, objetivo: para inmersión en agua de 60 aumentos

Capturado con la colaboración de: Dr. Satoshi Nishimura, Departamento de Medicina Cardiovascular, Universidad de Tokio, TSBMI, Universidad de Tokio, PRESTO, Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología


Cabezal de exploración confocal híbrido revolucionario

El sistema confocal A1R+ cuenta con un cabezal de exploración híbrido que incorpora un explorador resonante ultrarrápido y otro galvánico de alta resolución. La fotoactivación y la captura de imágenes ultrarrápida y simultánea con estos dos exploradores permiten la adquisición de cambios rápidos después de la fotoactivación y la observación de la interacción intermolecular.

A1R-Plus-Hybrid-Scanner

Células HeLa expresando amarillo camaleón 3.60, calibradas con luz láser de 457 nm. Después de la estimulación con histamina se observó la dinámica de concentración de iones de calcio. La emisión (azul) de CFP y la emisión (amarilla) de YFP se muestran como canales verde y rojo, respectivamente. La gráfica muestra la intensidad de fluorescencia (vertical) en comparación con el tiempo (horizontal). Las líneas verde y roja del gráfico indican el cambio de intensidad de la emisión de CFP (verde) e YFP (rojo) desde la región de interés (ROI). Junto con el aumento de la concentración de iones de calcio en la célula, la eficiencia de FRET entre CFP y YFP dentro del amarillo camaleón de 3.60 aumentos, la intensidad de fluorescencia de CFP disminuye y la intensidad de fluorescencia de YFP aumenta. Longitud de onda del láser de la captura de imágenes: 457 nm, tamaño de la imagen: 512 x 512 píxeles, 30 fps (con explorador resonante)

Fotos cortesía de: Dr. Kenta Saito y prof. Takeharu Nagai, Instituto de Investigación para la Ciencia Electrónica, Universidad de Hokkaido


Captura de imágenes de alta velocidad en vivo

El explorador resonante Nikon puede capturar imágenes a alta velocidad a 420 fps, la mayor rapidez posible para un microscopio multifotónico con tecnología de exploración de punta. Lo exclusivo de este diseño es un espejo de explorador resonante capaz de capturar campos de visión completos a velocidades mucho mayores que los explorador galvánicos tradicionales. El sistema cronométrico óptico de pixeles de Nikon, que monitorea la posición del espejo resonante en tiempo real, ajusta el reloj de píxel para asegurar una captura de imágenes más estable, geométricamente correcta e iluminada de forma más uniforme, incluso a altas velocidades. Esto permite la visualización exitosa en vivo de cambios rápidos, como las reacciones, dinámicas e interacciones celulares en organismos vivos.

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Imagen profunda de la muestra con detectores de alta sensibilidad de espectro amplio (NDD)

Las emisiones de fluorescencia desde la profundidad de una muestra son altamente diseminadas durante la excitación multifotónica, por lo tanto, el detector convencional que utiliza un orificio no puede capturar imágenes fluorescentes brillantes. El NDD episcópico del A1R MP+ se ubica cerca de la apertura posterior del objetivo para detectar el máximo de señales de emisión diseminadas desde la profundidad de las muestras vivas.

Imagen en vivo de las áreas profundas de la corteza cerebral de un ratón

Se estudió la corteza cerebral de un ratón de 5 semanas de vida (línea H) con el método craneal abierto. La forma completa de las dendritas de las células piramidales en la capa V expresan que el EYFP se visualizó desde la capa inferior hacia una capa superficial. Además se estudió la señal de fluorescencia de la sustancia blanca en áreas más profundas.

A1R-MPplus_NDD
Izquierda  Imagen de reconstrucción en 3D  

Fotografía con la colaboración de:
Dr. Tomomi Nemoto, Instituto de Ciencia Electrónica, Universidad de Hokkaido
Dr. Shigenori Nonaka, Instituto Nacional para la Biología Básica

Dr. Takeshi Imamura, Escuela de Medicina,
Universidad Ehime

Derecha     Imágenes de apilamiento en z      
  Parte superior:
dendritas en capas superficiales en las células piramidales de la capa en V, a 25 µm de la superficie
 
  Parte intermedia:
dendritas basales en las células piramidales de la capa V 625 µm de la superficie
 
 

Parte inferior:

fluorescencia de la sustancia blanca
Longitud de onda de excitación: 950 nm
Objetivo: apocromático CFI75 de 25 aumentos W MP (AN 1.10 D.T. 2.0)

 

Imágenes de color múltiple de corteza la cerebral del ratón

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Adquisición simultánea de tres canales en un ratón YFP-H anestesiado con excitación IR de 950 nm y generación de segundo armónico (SHG) y dos emisiones fluorescentes.
Cian: señal SHG de duramadre
Amarillo: neuronas piramidales EYFP en la capa en V de la corteza
Rojo: vasos sanguíneos etiquetados con SRB

Fotografía con la colaboración de:
Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi y Tomomi Nemoto, Instituo de Investigación para la Ciencia electrónica, Universidad de Hokkaido

Imágenes con representación de volumen en 3D

Representaciones de volumen tridimensionales de un riñón etiquetado con el marcador Hoxb7/myrVenus (Chi et ál, 2009, Genesis), con representación de volumen de pseudocolor con el código de profundidad para mostrar las profundidades Z (pseudocoloreado por profundidad - paso de 1 μm para 550 μm).

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Objetivo: apocromático CFI de 25 aumentos de W MP, aumento de exploración: 1 aumento, tamaño de paso Z: 1 μm, longitud de onda de excitación de IR: 930 nm
Resolución de las imágenes: 1024x1024 píxeles, volumen de las imágenes: 460 μm (largo) x 460 μm (ancho) x 600 μm (alto)
Fotografía con la colaboración del Dr. Frank Costantini y la Dr. Liza Pon, Centro Médico de la Universidad de Columbia, Nueva York


Imágenes de 1300 nm

Además del GaAsP de NDD compatible con una longitud de onda de 1080 nm, existe un nuevo modelo para los microscopios verticales compatibles con una longitud de onda de 1300 nm. Este nuevo NDD permite la captura de imágenes profundas de hasta 1.4 mm en combinación con un nuevo cabezal de exploración compatible de A1R MP+ con una longitud de onda de 1300 nm.

Imágenes cerebrales profundas de un ratón en vivo con GaAsP de NDD, compatibles con la longitud de onda de 1300 nm.

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Fotografiada con la colaboración de: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi y Tomomi Nemoto, Instituto de Investigación para la Ciencia Electrónica, Universidad de Hokkaido

Imágenes en vivo de un ratón YFP-H anestesiado (de 4 semanas de vida) con el método craneal abierto. Visualización completa de las neuronas piramidales de la capa V y  neuronas más profundas del hipocampo. Captura de imágenes profundas para capturar imágenes tridimensionales de dendritas del hipocampo, hasta 1.4 mm dentro del cerebro.

Captado con GaAsP de NDD episódico para 1300 nm y lente objetivo apocromático CFI75 de 25 aumentos W MP1300 (AN 1.10, D.T. 2.0 mm)
Longitud de onda de excitación: 1040 nm

Imágenes a color dual de un ratón en vivo con el GaAsP de NDD, compatibles con la longitud de onda de 1300 nm

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Se estudió la corteza cerebral de un ratón YFP-H anestesiado (4 semanas) con el método de cráneo abierto.
Se inyectó la sustancia alexa594 en la vena caudal para visualizar el vaso sanguíneo.

Fotografía con la colaboración de: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi y Tomomi Nemoto, Instituto de Investigación para la Ciencia Electrónica, Universidad de Hokkaido.


NEW Dual IR Beam Option Enables Simultaneous Two-Color Multiphoton Imaging

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Live brain slice expressing YFP and Rhod-2, simultaneously excited with 900nm and 1040nm wavelengths (CFI75 LWD Apo 25x 1.1 NA W 1300nm objective).  A live slice culture from a YFP-VGAT rat stained with rhod-2 AM was imaged to measure mitochondrial calcium transients in hippocampal interneurons.

Image courtesy of Richard Kovacs, Ph.D., Institute for Neurophysiology, Charité-Medical University, Berlin, Germany

With the dual IR beam option, users can now simultaneously excite two different fluorophores such as GFP and mCherry.  This capability enables ultra-fast two-color multiphoton imaging, ideal for dynamic specimens.  The dual beams can also be used for stimulation at a specific wavelength and imaging with a different wavelength, reducing time delays normally present when using a single beam which requires mode locking to change wavelengths.

Three dimensional multiphoton image of a 1 dpf transgenic zebrafish (Tg(h2afv:GFP; EF1α: mCherry-zGem)).  Specimen was treated with Phenyltiourea (PTU), to inhibit melanin synthesis and clarified with optical clearing solution LUCID. This transgenic line expresses mCherry-tagged geminin and GFP-tagged histones.  Specimen was imaged with a CFI75 Apo 25xW MP1300 (1.10 N.A., 2.0 W.D.) objective and simultaneously excited with 900nm and 1040nm wavelengths.

Image courtesy of: Drs Toshiaki Mochizuki and Ichiro Masai, Developmental Neurobiology Unit, OKINAWA Institute of Science and Technology Graduate University

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Lateral view of the trunk of a transgenic zebrafish at 34 hpf (Tg(h2afv:GFP; EF1α: mCherry-CAAX)).  Specimen was treated with Phenyltiourea (PTU), to inhibit melanin synthesis and clarified with optical clearing solution LUCID.  This transgenic line expresses mCherry-tagged membrane proteins (purple) and GFP-histones (green).  Muscle fibers was also visualized using SHG (blue).  Specimen was imaged with a CFI75 Apo 25xW MP1300 (1.10 N.A., 2.0 W.D.) objective and simultaneously excited with 900nm (for SHG and GFP) and 1040nm (for mCherry) wavelengths.

Image courtesy of: Drs Toshiaki Mochizuki and Ichiro Masai, Developmental Neurobiology Unit, OKINAWA Institute of Science and Technology Graduate University


NEW Objective for Tissue Clearing Techniques

CFIPlan10xCGlyc

In the field of neuroscience research, there is an ever-increasing need to image deeper into intact brain tissues while maintaining high resolution and clarity.

CFI Plan Apochromat 10xC Glyc was developed to provide deep imaging capabilities for use with a wide variety of clearing techniques. 

The support of multiple refractive indices allows observation with not only water, oil and glycerin, but also with various optical clearing liquids. 

This new objective provides broad chromatic aberration correction and high transmission rates by incorporating Nikon’s exclusive Nano-Crystal Coat technology. 

This long-working-distance objective provides clear, high-contrast images deep inside the tissue with its high numerical aperture.

Whole mouse brain imaging with optical clearing method

CFIPlan10xCGlyc-diagram

PFC

Striatum

Hippocampus and Amygdala

Optical slices of H-line mouse whole brain after clearing with LUCID-A 
Objective: CFI Plan Apochromat 10xC Glyc (NA 0.5, WD 5.5) 
Photos courtesy of: Drs. Ryosuke Kawakami and Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University


Los objetivos de alta AN de Nikon son ideales para la captura de imágenes multifotónica

Se han desarrollado objetivos de alta AN que corrigen en gran medida las aberraciones cromáticas en una amplia gama de longitudes de onda, de ultravioleta a infrarrojo. La transmisión se incrementa por medio del uso de la exclusiva tecnología de recubrimiento de nanocristales de Nikon.

En particular, las lentes objetivo aprocromáticas CFI75 de 25 aumentos W MP/MP1300 capturan una apertura numérica líder en el mercado de 1.10 y mantienen una distancia de trabajo de 2.0 mm. También tienen un collar que corrige las aberraciones esféricas según la profundidad de la muestra y un ángulo de acceso de la pipeta del manipulador de 33°, por lo cual son ideales para captura de imágenes multifotónica profundas y aplicaciones de investigación en la fisiología.
El recubrimiento de nanocristales es una tecnología de recubrimiento de lentes exclusivas de Nikon, que utiliza una película delgada de nanopartículas con un índice de refracción ultrabajo para la industria de los semiconductores. La estructura de las partículas del recubrimiento de nanocristales reduce notablemente el escape de reflexiones y mejora la transmisión en una amplia gama de longitudes de onda para producir imágenes con mayores coeficientes de señal/ruido (S/R).

high-NA1

CFI75 Apochromat 25xW MP CFI Apochromat LWD 40xWI λS

high-NA2

CFI Apochromat 40xWI λS CFI Plan Apochromat IR 60xWI

Objectives for multiphoton microscopy

CFI75 Apochromat
 25xW MP1300
NA 1.10 WD 2.0 Nano Crystal Coat
CFI75 Apochromat
 25xW MP
NA 1.10 WD 2.0 Nano Crystal Coat
CFI Apochromat LWD
 40xWI λS
NA 1.15 WD 0.6 Nano Crystal Coat
CFI Apochromat
 40xWI λS
NA 1.25 WD 0.18 Nano Crystal Coat
CFI Plan Apochromat
 IR 60xWI
NA 1.27 WD 0.17 Nano Crystal Coat

Alineación automática de láser al cambiar la longitud de onda de excitación multifotónica

Auto Laser Alignment

Cuando se cambia la longitud de onda del láser multifotónico o la precompensación de dispersión de la velocidad de grupo, la orientación posicional del rayo láser en la apertura posterior del objetivo también puede cambiar, lo que genera una intensidad desigual a través de la imagen o una ligera desalineación entre las trayectorias de luz láser visible  y de IR.

Siempre ha sido difícil verificar la orientación del rayo láser IR y fijar la alineación. La función de alineación automática del láser del confocal A1R MP+, ubicada en la unidad óptica incidente para la trayectoria de la luz de excitación multifotónica, maximiza automáticamente las alineaciones del láser IR en un solo clic a través del software NIS-Elements C.


Mayor flexibilidad y facilidad de uso

El software de control NIS-Elements C permite el control integrado del sistema de captura de imágenes confocal, el microscopio y los dispositivos periféricos con una interfaz sencilla e intuitiva. También existen diversas y confiables funciones de análisis disponibles.


Two Types of Scanning Heads Enable High-speed, High-quality Imaging

Scanning Heads

A1R MP+ has a hybrid scanning head that incorporates both a high-resolution galvano scanner and an ultrahigh-speed resonant scanner. The galvano scanner enables imaging up to 4096 x 4096 pixels and high-speed acquisition of 10 fps (512 x 512 pixels). A new A1R MP+ system is now available which is compatible with a wavelength of 1300 nm.



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