Les lampes à arc au mercure et au xénon sont aujourd’hui largement utilisées en guise de sources d’éclairage pour de nombreuses études dans le domaine de la microscopie à en fluorescence à champ large. Grâce à ce tutoriel interactif qui simule la manière dont l’ampoule est ajustée dans un microscope en fluorescence, les visiteurs peuvent s’entraîner à aligner et mettre au point l’ampoule à arc dans un brûleur au mercure ou au xénon…

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Nikon fabrique deux types d’huile à immersion pour la microscopie, qui sont de Type A et Type NF. Ces huiles sont testées en utilisant des objectifs Nikon et leurs performances ne peuvent donc pas être garanties avec des objectifs fabriqués par d’autres sociétés. Les indices de réfraction des autres huiles fabriquées peuvent être différents et il sera donc impossible d’obtenir les mêmes résultats qu’avec les huiles et les objectifs Nikon. Il est également important de remarquer qu'il ne faut pas mélanger des huiles différentes car cela nuirait aux performances optiques.

L’huile de type A est une huile universelle utilisée pour les applications d’imagerie nécessitant une immersion dans l'huile, notamment les techniques en fond clair, fond noir, phase et fluorescence. Elle est vendue en trois contenances de 8 ml, 50 ml et 500 ml avec une pipette fournie à chaque fois pour la distribution. Pour obtenir une fiche technique, veuillez [cliquer ici].

L’huile de type NF est considérée comme étant une huile de qualité supérieure conçue pour répondre au besoin d’améliorer les rapports signal-bruit dans la microscopie en fluorescence, en particulier dans les applications à faible éclairage ou celles entre 340 et 380 nm, typiquement associées à l’imagerie calcique ou à l’imagerie UV. Sa qualité améliorée est due aux matières premières utilisées dans l’huile qui permettent de réduire l’autofluorescence causée par les minéraux contenus dans l’huile. Cette huile est vendue en une seule contenance de 50 ml et est fournie avec une pipette en plastique pour l'appliquer. Elle est légèrement plus visqueuse et possède une légère odeur. Pour obtenir une fiche technique, veuillez [cliquer ici]. Pour obtenir des renseignements plus détaillés sur l’immersion dans l’huile, veuillez [cliquer ici]

Pour acheter de l’huile à immersion, veuillez localiser votre distributeur Nikon local dans la section « Points de vente ».

L’ampoule dont vous aurez besoin dépendra d’un certain nombre de facteurs énumérés ci-dessous. Les filaments et la conductivité des ampoules sont prévus spécifiquement pour leur usage en microscopie. Cela procure non seulement une plus grande régularité de l’éclairage mais aussi une durée de vie plus longue de l’ampoule. C’est pourquoi Nikon recommande de ne pas utiliser d’ampoules non spécifiques.

Tungstène (W), halogène, mercure (Hg), xénon (Xe) ou halogénures

Cette information détermine le type d’éclairage requis mais est spécifique au type d’éclairage dans lequel l’ampoule devra être installée.

Tension et puissance

Ces données constituent habituellement les indicateurs les plus significatifs lorsqu’ils sont présentés avec le modèle du microscope et le type d’ampoule. On peut trouver généralement ces données sur l’emballage d’origine ou imprimées à proximité des contacts.

Forme

Une fois que vous avez déterminé de quel type d’éclairage vous avez besoin, vous devez déterminer la forme nécessaire. Les types d’ampoules les plus courants incluent les ampoules ovales, arrondies et à surface réfléchissante. Des exemples de types d’ampoules sont joints.

Type de microscope Si vous pouvez déterminer le modèle du microscope et le type d’éclairage, cela devrait suffire pour déterminer quel type d’ampoule est nécessaire. Les types d’éclairage comprennent notamment les éclairages à fluorescence, diascopiques et à pointeur pour les têtes d’enseignement.

Pour acheter une ampoule, veuillez localiser votre distributeur Nikon local dans la section « Points de vente ».

Étant donné l’étendue de la gamme d’objectifs modernes actuellement disponibles, il peut s’avérer difficile de choisir le type d’objectif adapté à votre application.

Ce guide présente les types de base d’objectifs et identifie les critères à utiliser pour sélectionner l’objectif le mieux adapté à votre application, de la microscopie en fond clair à la microscopie confocale et l'imagerie des cellules vivantes.

Classes d’objectifs

Les objectifs sont réparties en 3 groupes fondamentaux : achromatiques, fluor et apochromatiques.

Typiquement, les objectifs Achromat ou Plan Achromat sont conçus pour concentrer le bleu (environ 486 nm ou aussi appelé la ligne f) et le rouge (656 nm, ligne c) dans le même plan en assurant la correction de l’aberration chromatique axiale. Parfaits pour la microscopie en fond clair de base, il s’agit de loin des objectifs les moins coûteux du marché.

Les objectifs à fluorine ou Plan Fluor sont la classe immédiatement supérieure et sont fabriqués dans un verre couvert d'un revêtement spécial qui permet d'obtenir des vitesses de transmission supérieures et de ce fait des images plus lumineuses. En plus d’assurer une correction axiale pour le rouge et le bleu, les objectifs à fluorine présentent aussi généralement une correction du vert (588 nm, aussi appelé ligne d) ainsi que des corrections sphériques supplémentaires par rapport aux objectifs achromatiques.

La classe d’objectifs la plus élevée est composée des objectifs Plan Apochromat. En plus des corrections ci-dessus, les objectifs Plan Apochromat présentent également une correction de la ligne g (436 nm). En outre, Nikon a introduit une série d’objectifs Plan Apochromat VC qui couvre aussi la ligne h (405 nm), et permet de corriger totalement l'aberration chromatique sur 5 lignes, de 405 à 656 nm. Les objectifs apochromatiques sont généralement les objectifs les plus coûteux qui offrent les images les plus nettes et les plus propres et le moins d’aberration chromatique.

Pour plus d’information sur les différentes classes d’objectifs, cliquez ici.

Techniques

Fond clair

Les objectifs achromatiques, fluors et apochromatiques peuvent être utilisés pour l’imagerie en fond clair. Les objectifs Plan Apochromat produisent les meilleures images tandis que les objectifs Plan Achromat et Plan Fluor peuvent atteindre des résultats de haute qualité en fonction de l’application et du budget.

Fluorescence

Les techniques de fluorescence nécessitent généralement l’utilisation d’objectifs Plan Fluor ou Plan Apochromat. L’objectif le mieux adapté à la fluorescence dépend largement de chaque application spécifique. Par exemple, si l’échantillon présente un signal de fluorescence très faible, les objectifs Fluor seront plus efficaces.

Fluorescence avancée et imagerie des cellules vivantes

Lors de l’activation et de l’imagerie de sondes fluorescentes telles que les protéines CFP, GFP, YFP, Cherry-FP (rouge cerise), Tomato-FP (rouge tomate), PA-GFP, Kaede, et PS-CFP, les optiques Plan Apochromat corrigé V sont fortement recommandées. L’aberration chromatique axiale étant corrigée jusqu’à la gamme du violet (405 nm), ces objectifs sont très efficaces pour l’utilisation de protéines PA-GFP, ainsi que d’autres protéines de photo-activation et photo-conversion qui peuvent être activées à 405 nm. Sans correction du violet, l’activation et l’imagerie de sondes multiples se fait dans des plans d’image légèrement différents. Les objectifs CFI Plan Apochromat VC constituent également un choix idéal pour les études confocales.

Non seulement les objectifs Plan Apochromat VC sont très efficaces dans la zone violette du spectre, mais ils fonctionnent également bien dans les infrarouges, ce qui permet une pénétration dans l'échantillon à une profondeur plus élevée. Ils sont également utiles pour les techniques d’imagerie cellulaire profonde.

Graphiques représentant les différences de position focale axiale des fluorochromes bleus lors de l’utilisation d’un objectif standard et d’un objectif Apo VC. Veuillez également remarquer l’augmentation du rapport signal-bruit.

TIRF

Lors de l’utilisation de la fluorescenhttp://admin.nikoninstruments.com/content/edit/12164/5/fre-FRce à réflexion interne totale (TIRF), les objectifs Apo TIRF de Nikon sont ceux qui garantissent le champ évanescent le moins profond possible avec les objectifs à immersion dans l'huile. Les objectifs Apo TIRF permettent une correction chromatique de 435 nm à 1064 nm avec une ouverture numérique de 1,49. De plus, ils possèdent un excellent débit infrarouge, qui facilite la capacité à imager et piéger des molécules isolées dans le même plan de mise au point.

Contraste de phase

Nikon propose toute une gamme d’objectifs à contraste de phase adaptés à différents échantillons.

Les objectifs DL (de l’anglais « Dark Low », sombre faible) produisent une image sombre sur un arrière-plan gris clair et sont adaptés aux échantillons présentant d’importantes différences de phase, comme par exemple les cellules. Ces objectifs constituent un choix très populaire pour les observations en contraste de phase.

Les objectifs DDL (de l’anglais « Dark Low Low », sombre faible faible) sont des objectifs flexibles pouvant être utilisés pour de nombreuses techniques, notamment les techniques DIC, fond clair, fond noir et fluorescence.

Les objectifs ADL (de l’anglais « Apodized Dark Low », sombre faible apodisé) réduisent les effets de halos indésirables souvent associés à l’imagerie en contraste de phase et permettent d’observer plus en détails l’intérieur des échantillons tels que les cellules.

Les objectifs DM (de l’anglais « Dark Medium », sombre moyen) sont adaptés aux échantillons présentant une très faible différence de phase, tels que les granules et les fibres fines.
 utilisé. Il s’agit typiquement d'objectifs Plan Apo ou Plan Fluor mais nous vous conseillons de contacter votre représentant Nikon afin de vous assurer de sélectionner un objectif compatible adapté à votre application.

Lumière polarisée

En cas d’utilisation de la lumière polarisée, il faut utiliser des objectifs sans déformation pour éliminer les effets optiques indésirables causés par les forces physiques également appelées « déformations » que subissent les éléments en verre de la lentille.

Autres Considérations

Longue distance de travail

La distance de travail peut être définie comme la distance qui sépare l’avant de l’objectif du verre couvre-objet située sur l’échantillon lorsqu’il est mis au point. Les applications qui nécessitent l’ajout de micromanipulateurs ou qui, alternativement, utilisent des cellules vivantes dans des cultures de tissus qui doivent être observées à travers les parois épaisses de cuves, tirent de grands avantages de l’utilisation  d’objectifs à distance de travail plus longue.

Objectifs multi-immersion - (Échantillons observés par immersion à eau, à huile, glycérine, ou à sec)

Il s’agit d’objectifs flexibles souvent utiles lorsqu’ils sont employés en guise d’objectifs compagnons à plus faible grossissement avec des objectifs à immersion à haute résolution, en particulier dans le domaine de la microscopie confocale

Objectifs à immersion à eau water-dipping – (Échantillons sans lamelle)

Conçus pour être immergés directement dans la boîte de culture de cellules, les objectifs à immersion dans l’eau présentent typiquement une ouverture numérique inférieure à celle des objectifs à immersion à eau.

Lorsqu’ils sont combinés avec une longue distance de travail, les objectifs à immersion à eau constituent un bon choix pour les applications de micromanipulation.

Objectifs à immersion à eau – (Échantillons avec lamelle)

Lorsque des cellules vivantes ou des tissus doivent être observés en profondeur dans l’échantillon, les objectifs à immersion à eau offrent des performances supérieures en termes de résolution et de correction des aberrations. Ils sont conçus pour être utilisés avec une lamelle et le chemin optique est maintenu symétrique lorsque la lumière passe des cellules (aqueuses) au verre (lamelle) puis à l’eau (milieu d’immersion) pour revenir ensuite au verre (lentille de l’objectif).

Bagues de correction

Les bagues de correction permettent à l’utilisateur d’ajuster les optiques pour tenir compte de certains paramètres tels que l’épaisseur du verre couvre-objet, le milieu d’immersion, l’indice de réfraction, la température et la profondeur de pénétration dans les tissus, afin d’atteindre des performances optimales.

Pour discuter de vos besoins plus en détail, veuillez localiser votre distributeur Nikon local dans la section « Points de vente ».

Il existe des centaines de combinaisons possibles avec de nombreux types de caméras et de microscopes différents. Les informations essentielles dont vous aurez besoin lorsque vous choisirez l’adaptateur à monture c dont vous avez besoin sont les suivantes:

Quels sont la marque et le modèle de votre microscope?

Ces informations sont importantes car les positions focales (point où les données d’image sont recueillies sur le capteur de la caméra) diffèrent d’un fabricant de microscope à l’autre. Généralement, sur les microscopes modernes, le type de modèle se situe sur le statif du microscope, parfois à côté du numéro de série. Si ce n’est pas le cas, le fabricant du microscope devrait être en mesure d’identifier le microscope grâce à sa description ou à une photo de ce dernier.

Quels sont la marque et le modèle de la caméra que vous souhaitez connecter?

Il s’agit d’une information importante car elle détermine habituellement le type de filetage ou de fixation que l'adaptateur à monture c doit posséder.

Quel port allez-vous utiliser??

Il n’est pas toujours possible de raccorder une caméra par le biais d'un port caméra prévu à cet effet (parfois appelé tube trinoculaire ou séparateur de faisceau). Il est important d’identifier le port que vous utiliserez pour la monture c.

Un grossissement est-il nécessaire?

Le capteur de la caméra (CCD) doit être d’une certaine dimension et nécessite un grossissement approprié dans l’adaptateur à monture c, que l’on appelle parfois lentille relais. En règle générale, on considère que, quelle que soit la taille du capteur CCD, sa valeur décimale correspond au grossissement nécessaire pour remplir le champ d’observation. Par exemple, un capteur CCD de 2/3’’ (0,67 pouce ou 16,9 mm) nécessite une monture c de 0,7x. La taille du capteur CCD doit toujours être communiquée par le fabricant.

Il est toujours bon de se souvenir qu’un grossissement plus faible donnera un champ d’observation plus large et des images généralement plus claires pour des expositions plus courtes. Pour voir un exemple de l’effet d’images de différentes tailles, cliquez-ici

Pour discuter de vos besoins, veuillez localiser votre distributeur Nikon local dans la section "Points de vente"

 Cela dépend des fluorochromes que vous avez l’intention d’utiliser dans votre application.

Le bloc-filtre abrite un filtre d'excitation, un miroir dichroïque (séparateur d efaisceaux) et un filtre barrière (ou d’émission), qui doivent correspondre aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de votre(vos) fluorochrome(s). Vous aurez besoin de connaître les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de vos fluorochromes avant de sélectionner les bonnes combinaisons filtre/dichroïque. Vous pouvez obtenir ces informations auprès de votre fournisseur de sondes.

Pour découvrir le système de sélection de bloc-filtre rapide et simple à utiliser conçu par Nikon et adapté à différentes sondes fluorescentes, [cliquez ici]

Pour plus d’information sur les combinaisons de filtres de fluorescence, [cliquez ici].

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Avec les progrès de la technologie numérique, la gamme de caméras s’est étendue, de même que la difficulté à faire son choix parmi les différents modèles proposés. Il y a quelques années, en particulier dans le domaine des caméras grand public, on pensait souvent que le nombre de pixels constituait un critère essentiel pour déterminer quelle était la meilleure caméra. Aujourd'hui, le niveau de connaissances est beaucoup plus élevé et il faut donc se poser un plus grand nombre de questions avant d'acheter une caméra appropriée. Pour vous aider à choisir la meilleure caméra en fonction de vos exigences, nous avons dressé une liste de questions supplémentaires qui vous aideront à découvrir quelle caméra est adaptée à vos applications.

Caméra grand public versus caméra destinée à la microscopie

Bien souvent, le prix et l’aspect pratique sont les éléments les plus importants pris en compte dans ce choix. Très souvent, on achète une caméra grand public pour réaliser des travaux de microscopie à cause des économies que l’on pense faire, du plus grand nombre de pixels et de la facilité avec laquelle on peut l’utiliser indépendamment du microscope. Si l’on considère ces facteurs de manière isolée, ils sont certes très avantageux, mais malheureusement, ils ne permettront pas d’obtenir les meilleures images avec votre microscope.

Dans le but d’augmenter le nombre de pixels, les caméras grand public ont tendance à utiliser des capteurs CCD moins coûteux qui risquent de présenter un nombre de pixels défectueux plus élevé. Ces pixels défectueux se manifestent sous forme de pixels chauds, pixels bloqués ou pixels morts.

Les caméras spécifiquement conçues pour la microscopie tendent à posséder une plus grande taille de pixel ce qui en réduit le nombre sur l’ensemble du CCD. Cependant, les pixels plus grands procurent un meilleur rapport signal-bruit et une qualité d’image de haut niveau.

Le verre et les lentilles utilisés dans les caméras grand public ne sont pas conçus pour fonctionner avec le verre utilisé en microscopie. Les caméras conçus pour la microscopie ne possèdent pas de verre intégré et sont donc plus compatibles grâce à l’utilisation d’une monture c spécifique.

Les caméras grand public présentent souvent des fonctions préréglées que l’on ne peut pas désactiver, telles que les fonctions d’amélioration de la netteté et du contraste.

Les caméras dédiées à la microscopie sont mieux adaptées aux techniques d'imagerie microscopie avancées, grâce à des logiciels spécifiques et des techniques telles que la télémicroscopie.

Monochrome contre couleur

Cette question se pose habituellement lorsque la sensibilité ou la vitesse sont d’une importance capitale. Avant de déterminer de quel type de caméra vous avez besoin, vous devez identifier quel type de résultats vous recherchez.

Dans les caméras à un seul CCD ou monochromes, il n’y a pas de couleurs affectées aux différents pixels. Les caméras monochromes tendent à posséder des pixels plus grands, ce qui signifie invariablement un moins grand nombre de pixels dans le CCD. Cela augmente leur sensibilité et la vitesse à laquelle ils peuvent recueillir des données d’imagerie. C’est pourquoi elles sont mieux adaptées à l’imagerie en fluorescence.

Les caméras couleur emploient des filtres de couleurs qui sont superposés aux pixels et sont rouges, verts ou bleus. Cela s’avère particulièrement utile pour les applications où la fidélité des couleurs est essentielle, comme par exemple lors de l’étude d'échantillons de tissus colorés ou dans la microscopie de polarisation.

Taille des pixels contre nombre de pixels

Les CCD sont généralement fabriqués en trois tailles : 1/3”, 1/2” et 2/3” (8,5 mm, 12,7 mm et 16,9 mm). La taille du CCD étant fixe, l’astuce consiste à utiliser l’espace entre les pixels appropriés.

Plus le nombre de pixels présents sur le CCD est élevé, plus les informations recueillies seront détaillées. Ce facteur est plus significatif dans les travaux à faible grossissement ou les observations macroscopiques. Cela signifie qu’il existe une plus grande incidence de défaillance des pixels avec la capacité d’obtention d’un bruit plus élevé qui dégradera l’image.

Plus la taille des pixels est grande, moins il y aura de pixels dans le CCD et plus la sensibilité sera élevée. Ce facteur est plus significatif dans les travaux à grossissement plus élevé où l’on enregistre de moins grandes surfaces ou bien dans les travaux d'imagerie nécessitant un rapport signal-bruit élevé

Résolution contre vitesse

Il s’agit du plus grand compromis auquel on doit faire face dans le domaine de l’imagerie microscopique. Alors que la nécessité de recueillir plus d’informations ou d’atteindre une bonne résolution augmente, la vitesse à laquelle les données sont recueillies et assimilées ralentit invariablement.

Les systèmes d’imagerie rapides utiliseront une surface ou un nombre de pixels moins élevés, augmentant de ce fait leur cadence de prise de vue ou leur vitesse d'acquisition de données.

Plus l’acquisition est rapide, moins le système dispose de temps pour recueillir des informations détaillées, avec pour résultat une réduction de la résolution ou du volume des données d’image.

Options de refroidissement

Pour encore améliorer le rapport signal-bruit pouvant être atteint, il est possible d’acheter des caméras possédant un capteur CCD refroidi en option.

Le CCD est refroidi soit à une température spécifique, soit à une température paramétrée à un certain niveau en-dessous de la température ambiante.

Le refroidissement du capteur permet de réduire les interférences causées par les fluctuations de température et le bruit.

On trouve des CCD refroidis sur les caméras monochromes et sur certaines caméras couleurs.

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